Pytania Naukowe

  1. Nano-pułapki
  2. Przeciwciała: Nanobodies / V H Hs
  3. Przeciwciała: IgG
  4. Nano-boostery i nano-etykiety
  5. Chromobodies
  6. Akcesoria
pułapki
pułapki


FAQ na temat pułapek nano

  1. Czy jest jakaś różnica w wiązaniu, gdy używam fuzji N-końcowej z C-końcową GFP?
    GFP Trap ® ma nieco większe powinowactwo dla C-końcowej fuzji GFP. Możesz to zrównoważyć wydłużonym czasem inkubacji (1-2 godziny zamiast 15–30 minut).
  2. Czy można eluować związane białka z GFP-Trap® za pomocą wolnego GFP?
    Możesz spróbować eluować za pomocą bezpłatnego GFP. Należy jednak pamiętać, że ta metoda nie eluuje ilościowo białka fuzyjnego będącego przedmiotem zainteresowania.
  3. Czy GFP-Trap wiąże TurboGFP?
    Nie, pułapka GFP nie wiąże TurboGFP. TurboGFP to zielone białko fluorescencyjne pochodzące z CopGFP widłonka Pontellina plumata, podczas gdy GFP pierwotnie wyizolowano z meduzy Aequorea Victoria . Turbo-GFP ma tylko ~ 20% identyczności sekwencji z powszechnie stosowanymi wariantami GFP.
  4. Czy mogę oczyścić białka fuzyjne znakowane GFP bezpośrednio z próbek tkanek, tj. W buforze denaturującym?
    Zasadniczo GFP-Trap ® jest bardzo stabilny nawet w trudnych warunkach buforowych (np. Bufor RIPA zawierający 0,1% SDS lub 1 M mocznik).
  5. Czy eluowane białko wiążące GFP reaguje krzyżowo z drugorzędowym przeciwciałem swoistym dla Ig?
    Ponieważ białko wiążące stosowane w GFP Trap ® nie ma znaczącej homologii z kozy, myszy, szczura lub człowieka przeciwciała, niespecyficznych reakcji z drugorzędowym przeciwciałem specyficznym Ig nie powinno występować.
  6. Jaka jest zdolność wiązania GFP-Trap®?
    Agaroza GFP-Trap® i agaroza magnetyczna GFP-Trap® zwykle wiążą około 8 µg GFP na 10 µl zawiesiny, Dynabeads GFP-Trap wiążą około 1 µg na 10 µl zawiesiny.

Specyfikacje agarozy GFP-Trap, magnetycznej agarozy i Dynabeads

  1. GFP-Trap
  2. Agaroza
  3. Agaroza magnetyczna
  4. Dynabeads
  5. Matryca
  6. Agaroza (4% usieciowana)
  7. Agaroza magnetyczna (usieciowana w 6%)
  8. Dynabeads M-270
  9. Postać koralika
  10. porowaty
  11. Porowaty; sprzedany żelazny rdzeń
  12. solidny
  13. Ligand
  14. GFP VHH
  15. GFP VHH
  16. GFP VHH
  17. Rozmiar białka znakowanego GFP *
  18. Mały do ​​dużego rozmiaru
  19. Mały do ​​dużego rozmiaru
  20. Mały do ​​bardzo dużego rozmiaru; bez ograniczeń wielkości
  21. Kolor
  22. Biały
  23. czarny
  24. brązowy
  25. Średni rozmiar cząstek
  26. 90 µm
  27. 40 µm
  28. 2,8 µm
  29. Zdolność wiązania
  30. 12 µg / 10 µl
  31. 8 µg / 10 µl
  32. 1 μg / 10 μl
  33. tło
  34. Bardzo niska
  35. Niska
  36. Niska
  37. Separacja magnetyczna i automatyzacja
  38. Nie
  39. tak
  40. tak
  41. Można odwirować do
  42. 2500 xg
  43. 800 xg
  44. 8 000 xg
  • Zależy od wielkości i kształtu białka, multimerów białka, kompleksów i partnerów interakcji

Jakie są parametry biofizyczne GFP-Trap®?
Masa cząsteczkowa: 13,9 kDa; Współczynnik ekstynkcji: 27055 M-1 cm-1

Jakie są parametry biofizyczne RFP-Trap®?
Masa cząsteczkowa: 14,9 kDa; Współczynnik ekstynkcji: 30035 M-1 cm-1

Czy Myc-Trap wiąże endogenne białko c-Myc?
Nie mogliśmy wykryć wiązania endogennego białka c-Myc z Myc-Trap . Niektóre reszty epitopowe, które okazały się kluczowe dla wiązania się z Myc-Trap, są zakopane w trójwymiarowej strukturze białka c-Myc. Dlatego w warunkach natywnych białko c-Myc nie jest odpowiednim partnerem wiązania dla Myc-Trap.

Jak delikatnie wyeluować natywne białko znakowane Myc z Myc-Trap?
Możesz eluować swoją fuzję Myc w sposób konkurencyjny za pomocą 1x lub 2x peptydu Myc. Alternatywnie można użyć 8 M mocznika lub 0,2 M glicyny o pH 2,5 w temperaturze pokojowej.

Czy powinienem użyć 1x Myc- lub 2x Myc-peptydu do elucji Myc-Trap?
Prawdopodobnie pułapka Myc wiąże kilka motywów podwójnego znacznika Myc. Stąd elucja białka fuzyjnego znakowanego Myc jest bardziej wydajna z 2x peptydem Myc . Ponadto termin „znacznik Myc” może odnosić się do pojedynczego lub podwójnego znacznika Myc. Aby być bezpiecznym, na ogół zalecamy elucję 2x peptydem Myc.

Czy powinienem używać fuzji punktowych N-końcowych lub C-końcowych? Czy mogę również wstawić Spot-Tag na środku mojego białka?
Zarówno fuzja N-, jak i C-końcowa działa dobrze.
Wykorzystanie Spot-Tag do wewnętrznego znakowania białka musi być sprawdzane indywidualnie dla każdego przypadku. Peptyd Spot-Tag musi istnieć w formie liniowej i być dostępny bez przeszkód przestrzennych z innych części białka będącego przedmiotem zainteresowania. Wewnętrzny tag punktowy zostanie rozpoznany przez nanokomórkę tylko wtedy, gdy zostanie wstawiony do wystarczająco dużej i nieustrukturyzowanej pętli, z natury nieustrukturyzowanej domeny lub długiego linkera domen.

Jak mogę eluować związane białko znakowane punktowo z Spot-Trap w jego natywnym stanie?
Możesz eluować swoją fuzję punktową w sposób konkurencyjny za pomocą peptydu Spot . Alternatywnie można użyć 10 mM NaOH pH 12 (dostosować pH natychmiast po elucji).

Jak mogę wykryć fuzję punktową w aplikacji Western blot?
Możesz użyć ChromoTek’s Spot-Label do wykrycia swojego białka fuzyjnego z tagiem Spot. Alternatywnie można zastosować białko wiążące Spot ChromoTek (Spot VH H, kod produktu: etx-250), a następnie inkubować z konwencjonalnym drugorzędowym przeciwciałem anty-Lama lub anty-His6.

Jak długo powinienem inkubować moją próbkę fuzji Spot z etykietą Spot-Label do aplikacji Western blot i IF?
Optymalne wyniki osiąga się przez nocną inkubację.

Czy powinienem stosować N-końcowy lub C-końcowy znacznik fuzji?
Zarówno N-końcowy, jak i C-końcowy znacznik fuzyjny działają dobrze z pułapkami.

Jak mogę uniknąć niespecyficznych interakcji białek wiążących się z pułapką?
W celu wstępnego wyczyszczenia próbki zalecamy użycie naszych kontroli wiązania (bab-20 lub bmab-20).

Więcej informacji znajdziesz w naszym Przewodniku rozwiązywania problemów

Jak mogę eluować związane białka z pułapki w ich naturalnym stanie?
Możesz eluować swoje interesujące białko fuzyjne za pomocą 0,2 M glicyny o pH 2,5 w temperaturze pokojowej. Pipetuj koraliki w górę iw dół przez 60-120 sekund i powtórz ten krok. Należy natychmiast zneutralizować supernatant, dodając 1 M zasady Tris pH 10,4.

Ile komórek ssaków jest wymaganych do reakcji immunoprecypitacyjnej?
W przypadku jednej reakcji immunoprecypitacyjnej zalecamy użycie ~ 10 ^ 6-10 ^ 7 komórek ssaków. Wydajność zależy również od poziomu ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania i partnerów interakcji.

Ile ekstraktu komórkowego powinienem użyć do reakcji immunoprecypitacyjnej?
W przypadku typów komórek innych niż komórki ssacze zalecamy stosowanie 0,5–1,0 mg ekstraktu komórkowego.

Czy muszę wymywać związane białka z perełek w celu analizy spektrometrii mas?
Nie, po immunoprecypitacji możesz bezpośrednio przeprowadzić trawienie na koraliku. Ta procedura pozwala na szybsze i bardziej wydajne przygotowanie próbki i potencjalnie wyższą wydajność.
Więcej informacji znajdziesz tutaj:

Zestaw Preomics

Protokół trawienia kulek

Czy muszę eluować moje interesujące białko z perełek do testów enzymatycznych?
Nie, możesz bezpośrednio wykonać test enzymatyczny na perełkach, jeśli aktywne centrum nie jest zablokowane.

Więcej informacji można znaleźć w nocie aplikacyjnej „test aktywności enzymatycznej”

Jakie są stałe dysocjacji nanopułapek?
Zasadniczo przeciwciała ciężkiego łańcucha mają wysokie powinowactwo do swoich antygenów ze stałymi dysocjacji w niskim nanomolarnym aż do zakresu pikomolarnego. ChromoTek określił następujące wartości KD:

  1. Pułapka GFP : 1 pM, pikomolarna (10-12 molowa) *
  2. Pułapka RFP : 5 nM, nanomolarna (10-9 molowa)
  3. Pułapka MBP : 4 nM, nanomolarna (10-9 molowa )
  4. GST-Trap : 1 nM, nanomolarny (10-9 molowy) *
  5. Myc-Trap (z 2x peptydem Myc): 0,5 nM, nanomolarny (10-9)
  6. Spot-Trap : 6 nM, nanomolarny (10-9 molowy)
  • Parametr kinetyczny został zmierzony za pomocą technologii switchSENSE z wykorzystaniem przełączalnych elektrycznie niwelatorów do analizy interakcji molekularnych. switchSENSE to zastrzeżona technologia Dynamic Biosensors (www.dynamic-biosensors.com ).

Jakiej ilości zawiesiny pułapkowej potrzebuję do jednej reakcji immunoprecypitacji?
25 µl zawiesiny wystarcza do jednej reakcji opadania, ponieważ powinowactwo pułapek jest bardzo wysokie.

Czy powinienem wstępnie wyczyścić próbkę podczas korzystania z Dynabeads GFP-Trap?
Matryca Dynabeads jest obojętna i nie powinna wiązać białek tła. Dlatego niesprzężone Dynabeads nie powinny być używane do wstępnego czyszczenia. Aby zbadać niespecyficzne wiązanie z Dynabeads GFP-Trap, zalecamy wykonanie IP z próbnym lizatem komórkowym bez fuzji GFP lub tylko z GFP.

Często zadawane pytania na temat przeciwciał: Nanobodies / VHH
Czy nanociała są monoklonalne czy poliklonalne?
W nanociała rekombinowane / monoklonalne.

Jakie są parametry biofizyczne nanobiał?
Imię MW (kDa) Współczynnik ekstynkcji molowej
(M-1 cm-1) Teoretyczny pI

  1. GFP V H H 13,9 27,055 9.4
  2. GST V H H 14,8 28,545 8.2
  3. Halo V H H 14,8 23,045 9.4
  4. Histon V H H 14.4 25,565 10.2
  5. MBP V H H 14.1 27,055 10,0
  6. Mdm4 / Hdmx V H H 13,6 14,565 10.1
  7. MK2 V H H 14.4 32,555 9.7
  8. mNeonGreen V H H

  1. Myc V H H 13.5 23,045 9,6
  2. p53 C-term V H H 14,8 34,170 9.2
  3. p53 N-term V H H 13,0 20,065 9.7
  4. PARP1 V H H 14.4 17,670 9.2
  5. RFP V H H 14,9 30,035 9.3
  6. Znacznik SNAP / CLIP V H H 13.1 24,075 9,8
  7. Punkt V H H (biwalentny) 30,3 46,340 5.3
  8. TurboGFP V H H 13,6 18,575 9.5
  9. Vimentin V H H 26,7 48,150 10,0


Czy nanociała mają jakieś tagi?
Tak, nanociała mają C-końcowy znacznik His6 .

Czy GFP VHH wiąże się z białkiem A lub białkiem G?
GFP V H H wiąże się z białkiem A, ale z białkiem G.

FAQ na temat przeciwciał: IgG
Czy przeciwciało Myc-tag [9E1] wiąże endogenne białko c-Myc?
Nie mogliśmy wykryć wiązania przeciwciała Myc-tag [9E1] z endogennym białkiem c-Myc. Niektóre reszty epitopowe, które okazały się kluczowe dla wiązania z przeciwciałem znacznika Myc, są zakopane w trójwymiarowej strukturze białka c-Myc. Dlatego w warunkach natywnych białko c-Myc nie jest odpowiednim partnerem wiązania dla przeciwciała Myc-tag [9E1].

Czy mogę użyć przeciwciała Myc-tag [9E1] do immunoprecypitacji?
Tak, możesz użyć przeciwciała Myc-tag [9E1] do immunoprecypitacji i unieruchomić go na kulkach poprzez białko A lub G.

Czy mogę użyć przeciwciała HA-tag [7C9] do immunoprecypitacji?
Tak, możesz użyć przeciwciała HA [7C9] do immunoprecypitacji i unieruchomić go na kulkach za pomocą białka A lub G.

Często zadawane pytania na temat Nano-boosterów i Nano-etykiet
Które koniugaty Nano-Booster i Nano-Label są zalecane do mikroskopii super-rozdzielczości?


Nano-boostery i nano-etykiety nadają się doskonale do mikroskopii super-rozdzielczości. Ze względu na mały rozmiar (2-3 nm) minimalizują błąd łączenia i zapewniają bardziej precyzyjne i gęste barwienie niż konwencjonalne przeciwciała (wymiar liniowy 15 nm. Wybór koniugatu Nano-Booster i Nano-Label zależy od twojego konfiguracja mikroskopu i lasery Zalecamy dla:

  • STED: ATTO647N, Abberior STAR 635P
  • STORM: Alexa Fluor 647, ATTO488
  • SIM: ATTO488 / 594

Czy nanotechnologie mają zastosowanie do obrazowania żywych komórek?
Nano-etykiety są małymi białkami i dlatego nie przenikają przez nieprzepuszczalne błony komórkowe. Jeśli chcesz dostarczyć Nano-Etykiety do żywych komórek, możesz zastosować metody transdukcji białka (np. Elektroporacja) lub odczynniki, jednak z naszego doświadczenia wynika, że ​​najbardziej skutecznym sposobem jest mikroiniekcja Nano-Etykiet.

(Obowiązuje dla Histone-Label i Vimentin-Label )

Czy Nano-Booster i Nano-Etykiety mają zastosowanie do obrazowania żywych komórek?
Tak, jeśli znacznik fuzyjny znajduje się na powierzchni komórki.
Nano-boostery i nano-etykiety są małymi białkami i dlatego nie przenikają przez nieprzepuszczalne błony komórkowe. Dlatego jeśli twoje białko fuzyjne jest wewnątrzkomórkowe, możesz zastosować metody transdukcji białka (np. Elektroporację) lub odczynniki, jednak z naszego doświadczenia wynika, że ​​najskuteczniejszym sposobem jest mikroiniekcja nanowzmacniaczy i nano-etykiet.

Czy mogę wykonać jednoczesne barwienie za pomocą dwóch lub więcej nanowzmacniaczy i nano-etykiet?
Tak, możesz łączyć Nano-Boostery i Nano-Etykiety . Na przykład, jeśli zazwyczaj używasz nanowzmacniaczy w rozcieńczeniu 1: 200, powinieneś dodać 1 µl każdego z gba488 i rba594 do 200 µl roztworu blokującego w celu wspólnego barwienia.

Ile cząsteczek barwnika jest sprzężonych z nanowzmacniaczami i nano-etykietami?
Każda cząsteczka Nano-Booster i Nano-Label zawiera średnio 1-2 fluorofory. Nano-Wzmacniacze sprzężonym z Alexa Fluor ® barwniki są opisane w sposób ukierunkowaną i przeniesienia w sumie 2 fluoroforów na V H H. Nano-Boosterów znakowanych Atto647N posiadać maksymalnie 1 fluorofor na V H H w C-końcu.

Czy mogę wykonać dwukolorową mikroskopię w super rozdzielczości, łącząc wzmacniacze GFP i RFP?
Tak, dwukolorowy STORM z Nano- Boosterem opisano w Bleck i wsp., PNAS 2014 i Platonova i wsp., ACS Chem Biol 2015 .

Czy Nano-Boostery działają na ustalonych próbkach (metanolu)?
Tak. Barwienia nano-Booster działają równie dobrze po utrwaleniu za pomocą najczęściej stosowanych odczynników: paraformaldehydu, aldehydu glutarowego, metanolu (Kaplan i Ewers, 2015; Ries i in., 2012).

Jaki jest protokół barwienia zewnątrzkomórkowego białka fuzyjnego Nano-Booster i Nano-Label?
Inkubuj komórki z 1:25 Nano-Booster lub Nano-Label w pożywce wzrostowej przez 15 min w + 4 ° C, przemyj i zrób zdjęcie. Ten protokół podkreśli pulę błon plazmatycznych białka fuzyjnego.

Czy nanoodtwarzacze i nano-etykiety przenikają przez błony komórkowe żywych komórek?
Nie. Nanowzmacniacze i nanoplastyki są małymi białkami i dlatego nie przenikają przez nieprzepuszczalne błony komórkowe. Jeśli chcesz dostarczyć Nano-Booster i Nano-Etykiety do żywych komórek, możesz zastosować metody transdukcji białka (np. Elektroporację) lub odczynniki, jednak z naszego doświadczenia, najbardziej skutecznym sposobem jest mikroiniekcja Nano-Boosterów i Nano- Etykiety

Czy jest możliwe sprzężenie nanodo-boosterów i nanopoznak z innymi fluoroforami?
Tak. Można oznaczyć białko wiążące ChromoTek GFP (GFP V H H, kod produktu: gt-250), białko wiążące RFP (RFP V H H, kod produktu: rt-250) i białko wiążące Spot ( białko Spot H H , kod produktu: etb-250) z aktywowanymi NHS barwnikami fluorescencyjnymi zgodnie z instrukcjami producenta barwnika.
Uwaga: Spot V H H zawiera znacznik sortase na swoim końcu C (motyw rozpoznawania sortase LPETG), którego można użyć do sprzęgania.

Czy mogę zrobić IF w drożdżach za pomocą Nano-Boosterów?
Tak, barwienie immunologiczne drożdży za pomocą Nano-Boosterów jest w rzeczywistości prostsze niż w przypadku tradycyjnych przeciwciał (IgG), ponieważ Nano-Boostery mogą przenikać do ściany komórkowej drożdży ze względu na ich mały rozmiar. Aby uzyskać zoptymalizowany protokół barwienia drożdży za pomocą Nano-Boosterów (tutaj nanociała GFP), patrz Kaplan i Ewers, Nat Protoc. 2015 r .

Czy RFP-Booster rozpoznaje tdTomato?
Nie.

Często zadawane pytania na temat chromosomów
Czy chromochody są wyrażane konstytutywnie?
Tak, ekspresja Chromobody jest regulowana przez bezpośredniego wczesnego promotora CMV. Ten promotor umożliwia konstytutywną ekspresję Chromobody.

Czy Chromobodies działają tylko w żywych komórkach?
Tak, plazmid Chromobody jest wyrażany tylko w żywych komórkach. Komórki należy transfekować plazmidem Chromobody co najmniej przez noc, aby obserwować sygnał lokalizacji Chromobody. Alternatywnie komórki można utrwalić przed obrazowaniem.
Uwaga: Nie zalecamy naprawy komórek dla Histone-Chromobody .

Kiedy powinienem wyobrazić sobie moje komórki po transfekcji plazmidem Chromobody?
Sygnał Chromobody jest utrzymywany w komórce do 3 dni. Jednak zależy to również silnie od typu komórki.
Zalecamy zobrazowanie komórek 16-24 godzin po transfekcji.

Czy Chromobodies dyfundują przez błonę komórkową do pożywki wzrostowej?
Nie, Chromobodies to małe białka ulegające ekspresji w cytosolu. Nie są wydzielane do pożywki i pozostają w komórce tak długo, jak długo komórka zachowuje integralność błony plazmatycznej.

Czy Chromobodies są fluorogenne, czy emitują fluorescencję tylko po związaniu z celem?
Chromobodies chimeryczne składające się z białka V H H w fuzji z białkiem fluorescencyjnym. Utrzymują fluorescencję niezależnie od tego, czy są związani z celem, czy nie.

Czy mogę amplifikować plazmid Chromobody w bakteriach?
Tak, plazmidy Chromobody można namnażać w E. coli standardowymi technikami.

FAQ na temat akcesoriów
Czy mogę odzyskać koraliki z kolumny wirującej?
Tak, możesz przenieść koraliki z kolumn spinowych . Dodaj 500 µl buforu do kolumny wirującej, pipetuj w górę i w dół i przenieś zawiesinę kulek buforowych do świeżej probówki. Osadzić kulki przez 2 minuty przy 2500 x gi temperaturze pokojowej i usunąć bufor.

NanobodyImmunoprecypitacja GFP

  • rozwijane mCherry / RFPmikroskopia w super rozdzielczościspecyfikacja masy
  • Wtórne nanociałaTag punktowypotwierdzone przeciwciała
  • Koraliki GFPIP białek znakowanych MycObrazowanie komórek na żywo